本(běn)試(shì)劑盒只能用於科學研(yán)究
，不得(dé)用於醫學診斷

大鼠（Rat）核因子(zǐ)κB（NF-κB）ELISA檢(jiǎn)測試(shì)劑盒

使用說明書

檢(jiǎn)測原理

試(shì)劑盒採用雙(shuāng)抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試(shì)驗（ELISA） 。往預先包被核因子(zǐ)κB（NF-κB）抗體的包被微(wēi)孔中 ，依次加入標本(běn) 、標準品 、HRP標記的檢(jiǎn)測抗體，經過溫(wēn)育並che底洗滌 。用底物TMB顯色 ，TMB在過氧(yǎng)化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色 ，並在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的核因子(zǐ)κB（NF-κB）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值） ，計算樣品濃度 。

樣品收集、處理及保存方(fāng)法

1.  血清 ：使用不含熱原和內毒(dú)素的試(shì)管，操(cāo)作過程中避免任何(hé)細(xì)胞刺激(jī) ，收集血液後 ，3000轉(zhuǎn)離心10分(fèn)鐘(zhōng)將血清和紅(hóng)細(xì)胞迅速小心地分(fèn)離 。

2.  血漿 ：EDTA 、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分(fèn)鐘(zhōng)取上清。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分(fèn)鐘(zhōng)去除(chú)顆粒和聚合物 。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分(fèn)鐘(zhōng)取上清 。

5.  保存 ：如果樣本(běn)收集後不及時檢(jiǎn)測 ，請按一次用量分(fèn)裝(zhuāng) ，凍存於-20℃，避免反復凍融 ，在室溫(wēn)下解凍並確(què)保樣品均勻地充分(fèn)解凍 。

自備(bèi)物品

1. 酶標儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL 、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恆溫(wēn)箱

操(cāo)作注意事項(xiàng)

1.  試(shì)劑盒保存在2-8℃ ，使用前室溫(wēn)平衡20分(fèn)鐘(zhōng)
。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬於正常現象 ，水浴加熱使結(jié)晶wan全溶(róng)解後再使用。

2.  實驗中不用的板條應(yīng)立(lì)即放回自封袋中 ，密封（低溫(wēn)乾(gàn)燥）保存。

3.  濃度為(wéi)0的S0號標準品即可(kě)視為(wéi)陰(yīn)性對照或者空(kōng)白；按照說明書操(cāo)作時樣本(běn)已經稀釋5倍 ，最終結(jié)果乘以5才是樣本(běn)實際濃度 。

4.  嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序(xù)進行溫(wēn)育操(cāo)作。

5.  所有液體組分(fèn)使用前充分(fèn)搖勻 。

試(shì)劑盒組成

注
：標準品（S0-S5）濃度依次為(wéi) ：0、75 、150 、300 、600
、1200 pg/mL

試(shì)劑的準備(bèi)

 20×洗滌緩衝液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋 ，即1份的20×洗滌緩衝液加19份的蒸餾水 。

洗板方(fāng)法

1.  手工洗板 ：甩盡孔內液體，每孔加滿洗滌液 ，靜置1min後甩盡孔內液體，在吸水紙上拍乾(gàn) ，如此洗板5次。

2.  自動洗板機：每孔注入洗液350μL ，浸泡1min ，洗板5次 。

操(cāo)作步驟

1.  從室溫(wēn)平衡20min後的鋁箔袋中取出所需板條 ，剩餘板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設置標準品孔和樣本(běn)孔 ，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL ；

3.  樣本(běn)孔先加待測樣本(běn)10μL ，再加樣本(běn)稀釋液40μL；空(kōng)白孔不加 。

4.  除(chú)空(kōng)白孔外 ，標準品孔和樣本(běn)孔中每孔加入辣根過氧(yǎng)化物酶（HRP）標記的檢(jiǎn)測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔 ，37℃水浴鍋或恆溫(wēn)箱溫(wēn)育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍乾(gàn)，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍乾(gàn) ，如此重(zhòng)復洗板5次（也可(kě)用洗板機洗板） 。

6.  每孔加入底物A 、B各50μL
，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內 ，在450nm波長處測定各孔的OD值 。

結(jié)果判斷

 繪制標準曲線 ：在Excel工作表中
，以標準品濃度作橫坐標 ，對應(yīng)OD值作縱坐標 ，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方(fāng)程計算各樣本(běn)濃度值。 

試(shì)劑盒性能

1.  準確(què)性：標準品線性回歸與預期濃度相關係數R值，大於等於0.9900。

2.  靈敏度 ：zui低檢(jiǎn)測濃度小於1.0 pg/mL 。

3.  特異性 ：不與其它可(kě)溶(róng)性結(jié)構類似物交叉反應(yīng) 。

4.  重(zhòng)復性
：板內 、板間變異系數均小於15%。

5.  貯藏 ：2-8℃，避光防潮保存 。

6.  有效期：6個月

免責聲明

1.   試(shì)劑盒僅供研(yán)究使用，不得(dé)用於臨床實驗或人體實驗 ，否則所產生的一切後果 ，由實驗者承擔，本(běn)公(gōng)司(sī)概不負責
。

2.   嚴格按照說明書操(cāo)作，實驗者違反說明書操(cāo)作 ，後果由實驗者承擔 。