1  標本的採(cǎi)取和(hé)保存
可用作(zuò)elisa測定的標本十(shí)分廣泛 ，體液(yè)(如血清) 、分泌物(唾液(yè))和(hé)排泄物(如尿液(yè)、糞便)等均可作(zuò)標本以測定其中某種抗(kàng)體或抗(kàng)原成份。有些標本可直接(jiē)進行(xíng)測定(如血清、尿液(yè))，有些則需經預(yù)處(chù)理(如糞便和(hé)某些分泌物)。大部(bù)分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖(xiān)維蛋白原和(hé)抗(kàng)凝劑外，其他成份均同(tóng)等於血清 。制備血漿標本需借助(zhù)於抗(kàng)凝劑，而(ér)血清標本只要(yào)待血清自然凝固 、xue塊收縮後即可取得(dé) 。除特(tè)殊情(qíng)況外，在(zài)醫學檢驗中均以血清作(zuò)為檢測標本。

在(zài)ELISA中血漿和(hé)血清可同(tóng)等應(yīng)用。血清標本可按(àn)常規(guī)方法採(cǎi)集，應(yīng)注意避(bì)免溶血 ，紅細胞(bāo)溶解時會(huì)釋放出具(jù)有過氧化物酶活(huó)性(xìng)的物質，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會(huì)增加非特(tè)異(yì)性(xìng)顯(xiǎn)色 。 血清標本宜在(zài)新(xīn)鮮時檢測 。如有細菌污(wū)染 ，菌體中可能含有內源性(xìng)HRP，也會(huì)產生假陽性(xìng)反(fǎn)應(yīng)。如在(zài)冰箱中保存過久(jiǔ) ，其中的可發生聚合 ，在(zài)間接(jiē)法ELISA中可使本底加深 。一(yī)般說(shuō)來，在(zài)5天內測定的血清標本可放置於4℃，超(chāo)過一(yī)周測定的需低溫(wēn)冰存 。凍結血清融解後，蛋白質局部(bù)濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻(yún)宜輕緩，避(bì)免氣泡 ，可上下(xià)顛倒混和(hé) ，不要(yào)在(zài)混勻(yún)器上強烈振蕩。混濁或有沈(chén)澱的血清標本應(yīng)先(xiān)離心(xīn)或過濾，澄清後再檢測。反(fǎn)復(fù)凍融會(huì)使抗(kàng)體效價跌落(luò)，所以測抗(kàng)體的血清標本如需保存作(zuò)多(duō)次檢測，宜少量(liàng)分裝冰存 。保存血清自採(cǎi)集時就(jiù)應(yīng)注意無菌操(cāo)作(zuò)，也可加入適當防腐劑 。

2  試劑的準備
按(àn)試劑盒說(shuō)明(míng)書的要(yào)求(qiú)準備實驗中需用的試劑 。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括(kuò)用於洗滌的，應(yīng)為新(xīn)鮮的和(hé)高質量(liàng)的。自配的緩衝液(yè)應(yīng)用pH計(jì)測量(liàng)較(jiào)正 。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫(wēn)度與室溫(wēn)平衡後使用。試劑盒中本次試驗不需用的部(bù)分應(yīng)及(jí)時放回冰箱保存 。

3  加樣
在(zài)ELISA中一(yī)般有3次加樣步聚，即加標本 ，加酶結合物 ，加底物 。加樣時應(yīng)將所加物加在(zài)LEISA板孔的底部(bù)，避(bì)免加在(zài)孔壁(bì)上部(bù)，並注意不可濺出，不可產生氣泡。 加標本一(yī)般用微量(liàng)加樣器，按(àn)規(guī)定的量(liàng)加入板孔中 。每次加標本應(yīng)更(gèng)換吸嘴，以免發生交叉污(wū)染 ，也可用一(yī)次性(xìng)的定量(liàng)塑料管加樣。有此測定(如間接(jiē)法ELISA)需用稀釋的血清，可在(zài)試管中按(àn)規(guī)定的稀釋度稀釋後再加樣 。也可在(zài)板孔中加入稀釋液(yè)，再在(zài)其中加入血清標本 ，然後在(zài)微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和(hé) 。加酶結合物應(yīng)用液(yè)和(hé)底物應(yīng)用液(yè)時可用定量(liàng)多(duō)道加液(yè)器 ，使加液(yè)過程迅速(sù)完成 。

4  保溫(wēn)
在(zài)ELISA中一(yī)般有兩(liǎng)次抗(kàng)原抗(kàng)體反(fǎn)應(yīng) ，即加標本和(hé)加酶結合物後 。抗(kàng)原抗(kàng)體反(fǎn)應(yīng)的完成需要(yào)有一(yī)定的溫(wēn)度和(hé)時間，這一(yī)保溫(wēn)過程稱為溫(wēn)育(incubation)，有人(rén)稱之(zhī)為孵育 ，在(zài)ELISA中似不恰當 。 ELISA屬固相免疫測定 ，抗(kàng)原、抗(kàng)體的結合只在(zài)固相表(biǎo)面上發生。以抗(kàng)體包被的夾心(xīn)法為例，加入板孔中的標本，其中的抗(kàng)原並不是都有均等的和(hé)固相抗(kàng)結合的機會(huì)，只有最貼(tiē)近孔壁(bì)的一(yī)層溶液(yè)中的抗(kàng)原直接(jiē)與抗(kàng)體接(jiē)觸 。這是一(yī)個逐步平衡的過程 ，因此需經擴散才能達到反(fǎn)應(yīng)的終點。在(zài)其後加入的酶標記抗(kàng)體與固相抗(kàng)原的結合也同(tóng)樣如此
。這就(jiù)是為什(shén)麼ELISA反(fǎn)應(yīng)總是需要(yào)一(yī)定時間的溫(wēn)育 。

溫(wēn)育常採(cǎi)用的溫(wēn)度有43℃ 、37℃ 、室溫(wēn)和(hé)4℃(冰箱溫(wēn)度)等。37℃是實驗室中常用的保溫(wēn)溫(wēn)度，也是大多(duō)數(shù)抗(kàng)原抗(kàng)體結合的合適溫(wēn)度。在(zài)建立ELISA方法作(zuò)反(fǎn)應(yīng)動(dòng)力(lì)學研究(jiū)時 ，實驗表(biǎo)明(míng) ，兩(liǎng)次抗(kàng)原抗(kàng)體反(fǎn)應(yīng)一(yī)般在(zài)37℃經1-2小時，產物的生成可達頂(dǐng) 。為加速(sù)反(fǎn)應(yīng) ，可提高反(fǎn)應(yīng)的溫(wēn)度，有些試驗在(zài)43℃進行(xíng)，但不宜採(cǎi)用更(gèng)高的溫(wēn)度。抗(kàng)原抗(kàng)體反(fǎn)應(yīng)4℃ ，在(zài)放射(shè)免疫測定中多(duō)使反(fǎn)應(yīng)在(zài)冰箱中過夜 ，以形成最多(duō)的沈(chén)澱。但因所需時間太(tài)長，在(zài)ELISA中一(yī)般不予採(cǎi)用。